2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:Siglec9屬于免疫球蛋白超家族的成員,歸屬于CD33相關的Siglec,通過識別含有唾液酸的糖鏈結構,在細胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面發揮重要作用,同時參與調控機體的固有免疫和適應性免疫。Siglec9主要表達于免疫細胞,如中性粒細胞和單核細胞,在淋巴細胞和樹突狀細胞上也可表達。膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征,細菌內毒素刺激巨噬細胞產生大量的炎性因子,引起機體的抗炎因子和促炎因子失衡,嚴重時導致膿毒性休克和多器官功

2、能衰竭。本課題主要是通過基因工程技術,制備、表達抗Siglec9Fab段,并對其進行生物特性鑒定,通過體外活性實驗進一步探討該抗體在炎癥方面發揮的作用?! ⊙芯糠椒?  1.制備抗Siglec9抗體Fab利用前期篩選得到的陽性噬菌體,通過PCR技術擴增抗體輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH),經測序得到核酸和氨基酸序列并與數據庫比對。根據核酸序列設計引物,通過重疊延伸PCR技術將抗體輕鏈恒定區(CL)和重鏈恒定區(CH1)分別與輕鏈可

3、變區和重鏈可變區連接,獲得重組輕鏈(L)和重鏈(Fd)。經過限制性核酸內切酶酶切,L和Fd與表達載體pETDUET1連接,構建重組質粒pETDUET1Fab。將重組質粒pETDUET1Fab轉入大腸桿菌BL21,加入IPTG誘導表達,經蛋白純化系統得到抗Siglec9抗體Fab段?! ?.抗Siglc9抗體Fab段與抗原結合能力的鑒定和抗體親和力分析采用SDSPAGE和Westernblot鑒定抗Siglec9抗體Fab段,ELISA、

4、流式細胞儀和BiaceX100分別檢測抗Siglec9抗體Fab與Siglec9的特異性結合能力和抗體的親和力?! ?.抗Siglec9抗體Fab的體外實驗抗Siglec9抗體Fab作用于THP1細胞分化的巨噬細胞和人單核外周血單核細胞來源的巨噬細胞,通過QPCR和ELISA分別檢測炎性細胞因子的表達量,通過Westernblot檢測TLR4信號通路上蛋白磷酸化水平的變化?! ⊙芯拷Y果:  1.通過PCR技術成功擴增抗體可變區,經測序驗

5、證未產生無功能基因或發生基因突變,利用重疊延伸PCR技術連接抗體的可變區和恒定區,得到重組重鏈Fd和輕鏈L,重組原核系統表達質粒pETDUET1Fab成功構建。轉入大腸桿菌BL21表達,經蛋白純化系統純化得到抗Siglec9抗體Fab?! ?.SDSPAGE和Westernblot結果顯示抗Siglec9抗體Fab主要表達于上清中,分子量約27KD。ELISA、流式細胞儀結果顯示抗Siglec9抗體Fab特異性結合Siglec9。Bia

6、ceX100檢測得親和常數為6.58×107?! ?.QPCR和ELISA顯示抗Siglec9抗體Fab可有效的抑制促炎性細胞因子和促進抑炎性細胞因子的表達量,Westernblot顯示抗Siglec9抗體Fab可抑制TLR4信號通路上蛋白的磷酸化水平?! ⊙芯拷Y論:  本實驗研究成功制備抗Siglec9抗體Fab段,該抗體特異性結合Siglec9,并具有較高的親和力,體外實驗研究表明可明顯抑制促炎性細胞因子IFNβ、TNFα、IL1β

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